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NKT_Onefive激光器應用案例:STED受激發射損耗熒光顯微鏡

發布日期:2020-02-28

受激發射損耗熒光顯微鏡(STED)

熒光顯微鏡能夠以微結構對細胞區室進行高度特異性成像,同時獲得最高對比度。然而,由于衍射極限的存在,常規顯微鏡的分辨率被限制在半波長左右。為突破分辨率限制,在過去的幾十年間產生了多種不同的方法,如通過不斷開啟和關閉單個熒光光斑、結構化照明、光學波動或用損耗光減小光斑發光面積等。

STED技術是其中最為有效的光學超分辨方法之一。通過引入一束損耗光以受激發射的方式來抑制有效熒光的發射,STED可以實現超衍射極限的分辨率。自1994Stefan W. Hell提出以來,STED技術已日趨成熟。

工作原理:

STED受激發射損耗顯微鏡技術廣泛應用于生物、醫學和材料領域,以突破衍射極限、實現高分辨的熒光樣品顯微。在共聚焦掃描顯微鏡中,樣品被一束衍射極限的脈沖激光激發,伴隨的圈狀二級光束則是發色團發光時產生的紅移。

左:來自SUPERK的衍射極限激發光;中:來自Katana-HP的圈狀損耗光;

右:損耗后的超分辨率熒光信號。 

這就能夠使得共聚焦激發光團的外圈被耗散,而剩下的熒光就僅會從激發光團的中心收縮處發射。

熒光信號的時間表現。上:圈狀光斑中央的最小值; 下:圈狀光斑帶損耗光后。

SUPERK超連續譜激光器能夠提供可見光(VIS)及近紅外(NIR)范圍內的連續光譜、優秀的單模光束質量(M2<1.1)和皮秒(ps)級別的脈寬。與NKT Photonics的濾光片技術結合后,就可以轉變為可調諧激光器,從而優化可將光和近紅外區域內的每種光團的吸收激發。

SUPERK激光器經SUPERK SELECT后,在多個不同濾光范圍內的超連續譜激光透過率

Onefive KATANA HP高功率皮秒激光器也適用于可見光-近紅外范圍內的不同波長,能夠提供皮秒級別脈寬的激光脈沖,因此適用于作為STED的損耗光。

藍色:SUPERK Extreme EXW-12的光譜功率密度;紅色:KATANA HP激光器的可用波長

除了使用適當的波長和激光功率組合外,在STED顯微鏡中,精確調節激發光和損耗光脈沖的同步也至關重要,從而實現在每個熒光周期開始時同步激發光團的有效耗盡。

NKT Photonics的鎖模超連續譜激光器配備有NIM觸發輸出,內置可調觸發延遲的標準功能。Onefive KATANA HP皮秒激光器可以作為外部觸發輸入的從屬激光器,從而允許通過軟件精準、簡便的調整激勵和耗盡脈沖。

激發光和損耗光脈沖易于調制,可便捷地優化損耗光以獲得最佳分辨率

在實驗中,分辨率主要受所用發色團的光物理限制,這也是熒光顯微發展迅速的原因。因此,超連續譜激光器自由選擇激發波長的靈活性有助于為Vis-NIR波段熒光顯微未來的發展做好準備。

SuperK平臺與KATANA HP激光器系列產品的結合,是市場上STED熒光顯微產品的最佳交鑰匙解決方案之一,已經通過全球多個案例的成功驗證。其中最為知名的就是在德國徠卡顯微系統公司(Leica)SP8 X共聚焦顯微鏡中的應用,自201410月起Onefive已正式成為其脈沖受激發射損耗系統(STED)775nm專用激光源的獨家供應商。

共聚焦掃描顯微鏡圖像(左)與超分辨率STED圖像(右)的對比。來源于Leica TCS SP8 STED 3X顯微鏡(Courtesy of Leica Microsystems)。

 

適用于STED顯微鏡的硬件配置:

 

超連續譜激發光:

SuperK FIANIUM/ EXTREME

SuperK SELECT/VARIA

SuperK 保偏光纖傳輸

 

脈沖損耗光:

Onefive KATANA 08 HP(775 nm)

Onefive KATANA 06 HP(592 nm)

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